پژوهشگاه علوم غدد و متابولیسم

صفحات سایت / گروه اصلی

   -

غربالگری اختلالات متابولیک به کمک طیف سنجی جرمی

ظهور طيف سنجي جرمي متوالي (MS/MS) (Tandem mass spectrometry) تعداد بيماري هايي را که مي توان با سرعت و دقت بالا شناسايي کرد، ساده ساخته است. به کمک تکنيک MS/MS مي توان تا 55 ناهنجاري بيوشيميايي را شناسايي کرد. غربالگري نوزادان در بهبود پيش آگهي بسياري از اختلالات متابوليک مفيد و مؤثر شناخته شده است. با اين وجود هنوز در طيف بيماري هاي مورد نظر براي غربالگري اختلاف نظر وجود دارد که ناشي از عدم وجود آمار کافي در اين زمينه است.

در حال حاضر در کشورهاي پيشرفته، بيست و نه بيماري که بيست و دو تاي آن ها بيماري هاي متابوليک ارثي هستند در برنامه غربالگري نوزادان گنجانده شده اند. بيست و دو بيماري متابوليک ديگر نيز بر پايه اي اين غربالگري اوليه قابل تشخيص هستند. بيماري هاي ديگري نظير بيماري هاي ذخيره ليزوزومي نيز کانديد اضافه شدن به ليست بيماري هاي غربالگري هستند. غربالگري نوزادان در سال هاي 1960 و با ابداع تست Guthrie آغاز شد. تا سال ها، فنيل کتونوري و هيپوتيروئيديسم مادرزادي و چند بيماري محدود ديگر، تنها بيماري هايي بودند که در برنامه غربالگري گنجانده شده بودند.

از حدود سال 2000 و با استفاده از تکنيک MS/MS باور عمومي "يک تست-يک آنزيم-يک بيماري" که اساس تست گاتري بود به طور کامل متحول شد. در تکنيک MS/MS به کمک دو طيف سنج جرمي متوالي با سرعت بالا و مقدار کم نمونه مي توان تعداد زيادي از اختلالات بيوشيميايي شناسايي کرد. پس از آن بود که برنامه هاي غربالگري در مقياس وسيع در آمريکا، استراليا و عربستان آغاز شد.

در حال حاضر در کشورهاي مختلف از 30 بيماري تا 5 بيماري براي غربالگري نوزادان مد نظر قرار داده شده است. مزاياي غربالگري گسترده ي نوزادان اين است از ريسک بيماري هاي تشخيص داده نشده يا دير تشخيص داده شده اجتناب شده و از بسياري از موارد مرگ يا معلوليت شديد ممانعت به عمل مي آورد. در بسياري از موارد بيماري هايي که از طريق غربالگري تشخيص داده مي شوند به سادگي و با مداخله هاي تغذيه اي قابل درمان و کنترل هستند. باور عموم متخصصين بر اين است که غربالگري، پيش آگهي بسياري از بيماري ها نظير گلوتاريک اسيدوري تيپ I، تيروزينمي تيپ I و II ، آرژنينوسوکسينيک اسيدوري و نقايص اکسيداسيون اسيد چرب را بهبود مي بخشد.

مهمترين پيشرفت در انجام آزمايشات غربالگري ، ظهور طيف سنجي جرمي MS/MS به عنوان ابزاري در تشخيص بيماري هاي متابوليک ارثي است که امروزه در جهان به طور گسترده مورد استفاده قرار مي گيرد. بيماري هايي که از اين روش شناسايي مي شوند عبارتند از نقايص متابوليکي نظير آمينواسيدوپاتي ها، ارگانيک اسيدمي ها، و اختلالات اکسيداسيون اسيدهاي چرب. امروزه از قابليت بالاي MS/MS مي توان براي تشخيص اختلالات کربوهيدرات ها نظير گالاکتوزمي و بيماري هاي ذخيره ليزوزومي نيز بهره برد.

برخلاف روش هاي رايج غربالگري، MS/MS يک آناليت واحد را اندازه نمي گيرد (يک تست-يک بيماري)؛ بلکه پروفايل متابوليت ها را شناسايي و تعيين مقدار مي کند. ارزيابي يک نمونه لکه خون خشک توسط MS/MS مي تواند در مورد 60 اسيد آمينه، اسيل کارنيتين ها و نسبت ميان آن ها اطلاعات کافي جهت تشخيص حدود 40 بيماري متابوليک به دست دهد. البته تفسير اين اطلاعات بسيار پيچيده و سخت مي باشد.

نقص متابوليسم اسيدهاي آمينه و اسيل کارنيتين ها منجر به تغيير غلظت اين مولکول ها مي شود. برخي بيماري هاي متابوليک پروفايل ساده و مشخصي دارند؛ مانند سطح بالاي فنيل آلانين و نسبت فنيل آلانين به تيروزين در فنيل کتونوري. ولي بيشتر بيماري هاي متابوليک تفاوت هاي آشکاري نشان مي دهند. به عنوان مثال تغيير سطح پروپيونيل کارنيتين (C3) مي تواند به پروپيونيک اسيدمي، متيل مالونيک اسيدمي، کمبود مالتيپل کربوکسيلاز، و کمبود ويتامين B12 در مادر نسبت داده شود. در مورد 3-هيدروکسي ايزووالريل کارنيتين (C5OH)، هفت ارگانيک اسيدمي مختلف براي تشخيص افتراقي بايد مد نظر قرار گيرند که عبارتند از کمبود 3-متيل کروتونيل CoA کربوکسيلاز، کمبود 3-هيدروکسي 3-متيل گلوتاريل CoA لياز، کمبود مالتيپل کربوکسيلاز، کمبود 3-متيل گلوتاکونيل CoA هيدراتاز، کمبود بيوتينيداز، کمبود 2-متيل3-هيدروکسي بوتيريل CoA دهيدروژناز و کمبود بتا-کتوتيولاز.

مفهوم بيومارکرهاي اوليه و ثانويه

بيومارکرها مولکول هايي هستند که در مايعات بدن موجود بوده و اندازه گيري آن ها مي تواند براي بررسي فرايندهاي بيولوژيکي نرمال، وضعيت بيماري يا پاسخ به درمان مورد استفاده قرار بگيرد. در اين چارچوب، مارکرهاي اوليه در غربالگري نوزادان، متابوليت هايي هستند که مربوط به يک مسير بيوشيميايي تغيير يافته (کاهش يا افزايش يافته) در يک بيماري خاص هستند و از نظر تشخيصي ارزش دارند. در حاليکه بيومارکرهاي ثانويه، بيومارکرهايي هستند که نشان دهنده ي افزايش ريسک يک بيماري متابوليک هستند که در اين مورد مي توان به نسبت ميان آناليت ها اشاره کرد. رتبه بندي بيومارکرها، تفسير پروفايل اين متابوليت ها را تسهيل کرده و حساسيت تست ها را افزايش مي دهد. به عنوان مثال در تيروزينمي کبدي-کليوي (تيپ I)، افزايش سوکسينيل استون بيومارکر اوليه محسوب مي شود، در حاليکه تيروزين بيومارکر ثانويه است زيرا غلظت آن ممکن است افزايش يافته يا طبيعي باشد. علاوه بر اين هميشه افزايش تيروزين نشانه ي اين بيماري نيست. تيروزين در نوزادان نارس يا نوزاداني که با وزن پايين متولد مي شوند و عملکرد کبد در آن ها هنوز به طور کامل شکل نگرفته نيز افزايش مي يابد. استفاده از نسبت آناليت ها براي تفسير صحيح پروفايل متابوليت ها ضروري است. استفاده از اين نسبت ها ميزان نتايج مثبت کاذب را به ميزان کمتر از 01/0% کاهش داده و کارآيي آزمايشات غربالگري را بهبود مي بخشد. از آنجايي که نتيجه مثبت کاذب استرس زيادي براي خانواده ها ايجاد مي کند، تشخيص دقيق بيماري از اهميت ويژه اي برخوردار است. تفسير نتايج حاصل از غربالگري بايد توسط متخصص خبره که تسلط کافي بر بيوشيمي واکنش هاي متابوليسم و بيماري هاي متابوليک دارد انجام شود و موفقيت اين آناليز ها بيشتر از همه به مهارت آناليز کننده بستگي دارد.

فرايند آناليز

فاز آناليتيکال برنامه غربالگري با پردازش نمونه هاي لکه خون و تزريق آن ها به دستگاه MS/MS براي به دست آوردن پروفايل اسيدهاي آمينه و اسيل کارنيتين ها آغاز مي شود. چنانچه يک نتيجه ي غير طبيعي به دست بيايد، نمونه اوليه بايد مجدداً ارزيابي شود. اگر نتيجه ي غير طبيعي تکرار شود، يک نمونه ي ديگر بايد درخواست شود. معمولاً نظر بر اين است که نتيجه تست غربالگري در عرض 24 ساعت و تست تأييدي در عرض 48 ساعت و قبل از اينکه هرگونه علامتي در بيمار ظاهر گردد انجام شود.

در مطالعه اي که اخيراً منتشر شده است، Cutoff اسيدهاي آمينه و اسيل کارنيتين ها با استفاده از نتايج حاصل از آزمايش 25 ميليون کودک و مقايسه نتايج حاصل از جمعيت نرمال با بيش از ده هزار مورد مثبت حقيقي انجام شد. عليرغم ارزش آماري بالا، اين نتايج فقط براي 7 روز اول زندگي معتبر بود. در مجموع به نظر مي رسد که مقادير cutoff براي هر متابوليت و نسبت آن ، ميان جمعيت هاي مختلف و محدوده ي سني متفاوت متغير هستند و به همين دليل هر آزمايشگاه بايد مقادير cutoff خود را تعيين کرده و به طور منظم ارزيابي نمايد. کنترل کيفي نيز در اين آزمايشگاه ها بايد به طور دوره اي و منظم انجام شود.

نکات باليني

نتايج به دست آمده از تست هاي غربالگري بايد در زمينه باليني تفسير گردد. سن بارداري، وزن تولد، سن به روز،و بيماري هاي همراه، عواملي هستند که بايد مد نظر قرار گيرند. تغييرات غير اختصاصي پروفايل متابوليت ها معمولاً در نوزادان نارس و نوزاداني که با وزن کم متولد مي شوند به دليل نارس بودن عملکرد کبد و کليه ديده مي شود. بيشترين تغييراتي که در اين نوزادان ديده مي شود، بالا رفتن تيروزين و متيونين در پروفايل اسيدهاي آمينه است. افزايش آرژينين و اسيدهاي آمينه شاخه دار نيز در اين گروه از بيماران ديده مي شود که معمولاً به دليل متکي بودن گلوکونئوژنز و کتوژنز به متابوليسم اين ترکيبات است. در نوزادان نارس و نوزادان با وزن پايين، گوتامات نيز ممکن است کاهش نشان دهد.

وجود فاکتورهاي ريسک نظير رابطه خويشاوندي ميان والدين و وجود خواهر يا برادر مبتلا، نيازمند توجه ويژه اي به آزمايشات است.

نکات تغذيه اي

وضعيت تغذيه نيز در تفسير نتايج حاصل از تست هاي غربالگري اهميت به سزايي دارد. >*نوع تغذيه

مصرف مقادير زياد پروتئين در شير به افزايش اسيدهاي آمينه به خصوص متيونين و تيروزين منجر مي شود. تجويز شير خشک هاي غني از پروتئين يا شير گاو مي تواند سطح بعضي از اسيدهاي آمينه مانند فنيل آلانين يا تيروزين را افزايش دهد. اگر چنين مسائلي در تفسير تست ها در نظر گرفته نشود، ممکن است نتايج مثبت کاذب حاصل شود. بعضي از اسيل کارنيتين ها در نوزاداني که با شيرخشک حاوي مقادير بالاي اسيدهاي چرب زنجيره متوسط تغذيه مي شوند، افزايش مي يابند.

>*گرسنگي و سوءتغذيه

گرسنگي بيش از چهار تا شش ساعت باعث افزايش گلوکونئوژنز از اسيدهاي آمينه ي عضلات مي شود. در نتيجه، بيشتر اسيدهاي آمينه در گرسنگي طولاني کاهش مي يابند؛ به جز اسيدهاي آمينه شاخه دار که ممکن است افزايش يابند.

>*وضعيت کارنيتين

کارنيتين يک مشتق اسيد آمينه است که براي انتقال اسيدهاي چرب از سيتوزول به داخل ميتوکندري و متعاقباً تجزيه ي اسيدهاي آمينه به استيل کوآنزيم A طي بتا-اکسيداسيون و در نهايت توليد انرژي مورد نياز هستند. يک مولکول اسيد چرب با يک مولکول کارنيتين واکنش داده و يک مولکول اسيل کارنيتين ايجاد مي کند که طول زنجيره اسيل کارنيتين به تعداد کربن هاي اسيد چرب بستگي دارد. متابوليسم بسياري از اسيدهاي آمينه نيز با توليد ارگانيک اسيدهاي واسطه اي همراه است که به کوآنزيم A کونژوگه شده و بنابراين مي توانند با کارنيتين استريفيه شوند. کاهش سطح کارنيتين آزاد در دو حالت ممکن است رخ دهد: >>* بچه هايي که از مادران مبتلا به کمبود کارنيتين متولد مي شوند. >>* کاهش کارنيتين ثانويه به اختلال متابوليک

هر دوي اين حالات باعث مي شوند سطح کارنيتين براي کونژوگاسيون ريشه هاي اسيل کافي نباشد. در چنين حالاتي در صورت وجود ارگانيک اسيدمي يا نقايص اکسيداسيون اسيدهاي چرب، افزايش بيومارکرها کمتر بوده و احتمال دريافت نتايج منفي کاذب مي باشد. در چنين مواردي و در صورت پايين بودن سطح کارنيتين خون، بايد بعد از تجويز کارنيتين به ميزان mg/Kg 100 آزمايشات مجدداً تکرار شوند. در مقابل، در بچه هايي که تحت درمان با کارنيتين هستند، کارنيتين بالا نبايد به اختلالات متابوليک نسبت داده شود.

ساير مواردي که ممکن است سبب بالا رفتن بيومارکرها شوند

پروفايل غير طبيعي متابوليت ها هميشه نشان دهنده اختلال متابوليک نيست. در بچه هاي بستري که تحت درمان با آنتي بيوتيک هستند و گلوکز داخل وريدي و تغذيه تزريقي دريافت مي کنند، معمولاً اسيدهاي آمينه شاخه دار، متيونين، و آرژنين بالارفته و گلوتامات کاهش مي يابد. با توجه به حساسيت بالاي تکنيک MS/MS مي توان حاملين و هتروزيگوت هاي اختلالات متابوليک و مادران حامل را از طريق بالا بودن مارکرهاي اوليه شناسايي کرد. حتي کمبود ويتامين در مادر را مي توان با آزمايش نمونه خون نوزاد شناسايي نمود. پروفايل متابوليک نوزاداني که از مادران مبتلا به کمبود ريبوفلاوين متولد مي شوند الگوي تغيير يافته اي مشابه گلوتاريک اسيدوري تيپ I نشان مي دهد.

تست هاي تکميلي

تست هاي تکميلي در زمينه بيماري هاي متابوليک ارثي عبارتند از آناليز ارگانيک اسيدها در ادرار و آناليز اسيدهاي آمينه و آناليز اسيدهاي آمينه و اسيل کارنيتين ها در پلاسما يا سرم. وقتي که بيماري متابوليک هيچ پروفايل اختصاصي مشخصي ندارد، تشخيص قطعي با تعيين فعاليت آنزيم يا تعيين نقص ژنتيکي انجام مي شود. به عنوان مثال نقص آنزيم CPT-I با تغيير در پروفايل اسيل کارنيتين همراه است ولي تغييري در الگوي ارگانيک اسيدها نشان نمي دهد.

معمولاً بهتر است در نتيجه ي آزمايشات غربالگري تست هاي تکميلي مناسب و آزمايشگاه هايي که قابليت انجام تست ها را دارند معرفي و اطلاعات مربوط به نحوه نمونه گيري جهت اين تست ها ضميمه شود.

در جداولی که در فایل ضمیمه آورده شده اند در گروه هاي بيماري هاي اسيدهاي آمينه، ارگانيک اسيدمي ها و اختلالات اسيدهاي چرب، بيومارکرهاي اوليه و ثانويه مرتبط با بيماري و تست هاي لازم براي تأييد تشخيص آن ها خلاصه گردیده اند.